分子生物學(xué)試劑在基因測(cè)序技術(shù)中扮演著至關(guān)重要的角色，其核心作用貫穿了從樣本處理、文庫(kù)構(gòu)建到測(cè)序反應(yīng)的全過(guò)程。
1.樣本處理與核酸提取
（1）裂解與純化
裂解試劑：
化學(xué)裂解液（如胍鹽、表面活性劑）：破壞細(xì)胞膜和核膜，釋放核酸。
酶解法（如蛋白酶K、溶菌酶）：降解與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)（如組蛋白）。
物理輔助（如珠磨法、超聲破碎）：通過(guò)機(jī)械力加速細(xì)胞裂解。
純化試劑：
硅膜吸附柱：利用硅膠膜特異性吸附DNA/RNA，去除雜質(zhì)（如蛋白質(zhì)、多糖、抑制劑）。
磁珠法：磁性納米顆粒結(jié)合核酸，通過(guò)磁性分離快速純化。
緩沖液系統(tǒng)（如高鹽低pH）：優(yōu)化核酸與雜質(zhì)的結(jié)合差異，提升純度。
（2）核心作用
確保核酸的完整性（避免斷裂）和高純度（去除PCR抑制劑），為后續(xù)步驟提供高質(zhì)量模板。
2.文庫(kù)構(gòu)建（LibraryPreparation）
（1）核酸片段化
酶法片段化：
DNaseI：隨機(jī)切割DNA鏈，產(chǎn)生平末端或粘性末端。
轉(zhuǎn)座酶（Tagmentation）：同時(shí)完成片段化和接頭添加（如Nextera技術(shù)）。
超聲片段化：
超聲波將DNA打斷為特定長(zhǎng)度片段（如100~500bp），需配合穩(wěn)定劑（如Covaris試劑盒）。
（2）接頭連接與修飾
接頭（Adapter）：
包含測(cè)序引物結(jié)合位點(diǎn)、索引序列（Index）和標(biāo)簽序列，用于區(qū)分不同樣本。
T4DNA連接酶：催化DNA片段與接頭的共價(jià)連接。
末端修復(fù)：
Taq聚合酶：填補(bǔ)5'端突出末端，生成鈍末端。
Klenow酶：修復(fù)3'端凹槽并加dA尾（與TruSeq接頭匹配）。
磷酸化與連接效率增強(qiáng)劑：
ATP和T4PNK酶：對(duì)接頭進(jìn)行5'磷酸化，提高連接穩(wěn)定性。
（3）核心作用
確保文庫(kù)的均一性（片段長(zhǎng)度一致）和特異性（接頭正確連接），避免測(cè)序偏差。
3.分子生物學(xué)試劑測(cè)序反應(yīng)中的試劑
（1）PCR擴(kuò)增與富集
PCR試劑：
HotStartTaq酶：減少非特異性擴(kuò)增，提高文庫(kù)富集效率。
dNTPs：提供DNA合成原料，需平衡濃度以避免錯(cuò)誤摻入。
Mg??/DMSO：優(yōu)化PCR反應(yīng)體系的離子強(qiáng)度和變性溫度。
目的：通過(guò)有限循環(huán)PCR（如10~15次）放大文庫(kù)，避免過(guò)度擴(kuò)增導(dǎo)致偏好性。
（2）測(cè)序模板制備
單分子模板制備：
乳液PCR（emulsionPCR）：用于454焦磷酸測(cè)序，通過(guò)微珠包裹單個(gè)DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。
橋式PCR（BridgePCR）：在FlowCell表面生成DNA簇（如Illumina技術(shù)）。
核心試劑：
Phi29聚合酶：用于多重置換擴(kuò)增（MDA），生成滾動(dòng)環(huán)狀DNA（RDA）。
（3）測(cè)序反應(yīng)體系
熒光標(biāo)記與終止劑：
ddNTPs（雙脫氧核苷酸）：用于Sanger測(cè)序，終止鏈延伸并標(biāo)記熒光。
可逆終止劑：Illumina邊合成邊測(cè)序（SBS）中使用，暫時(shí)阻斷鏈延伸后化學(xué)去除。
聚合酶與底物：
DNA聚合酶：催化核苷酸摻入（如Illumina的高性能酶減少錯(cuò)誤率）。
引物與模板結(jié)合緩沖液：維持測(cè)序反應(yīng)的高特異性。
更新時(shí)間：2025-07-18
點(diǎn)擊次數(shù)：190
當(dāng)前位置：
上一個(gè)：
返回列表