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細(xì)胞凋亡檢測(cè)及分子生物學(xué)檢測(cè)步驟

更新時(shí)間:2023-11-22點(diǎn)擊次數(shù):1609

細(xì)胞凋亡檢測(cè)及分子生物學(xué)檢測(cè)步驟:

1、細(xì)胞DNA 含量分布( 由細(xì)胞DNA 降解方式檢測(cè)細(xì)胞凋亡) 

    收集已固定的單細(xì)胞懸液約 5× 105~1 × 106/ml;

    離心除去固定液, 3ml PBS 重懸細(xì)胞;

   使用低速離心機(jī) 1500rpm  離心, 5 分鐘 ,棄去 PBS;

   加 PI 染液 1ml,室溫避光 20 分鐘;

   調(diào)整細(xì)胞濃度 5× 105/ml;

   上機(jī)檢測(cè)。

細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒.jpg

2 、磷脂酰絲氨酸外翻分析檢測(cè)細(xì)胞凋亡

1)      常 規(guī) 制 備 單 細(xì) 胞 懸 液 ,  用 PBS   洗 兩 次 .(  若 為 全 血 要 先 溶  血),取約 5× 106 個(gè)細(xì)胞,1500rpm 離心,棄上清,用 400μl 1 ×Binding Buffer 重懸;

2)   分成 a 、b 、c 、d 、e 五管,每管約 1× 106 個(gè)細(xì)胞

a)    陰性對(duì)照,不加任何試劑;

b)    陽性對(duì)照,加 2%多聚甲醛固定 30 分鐘,加 AnnexinV 5μl, 室溫 10min , 用 1 ×Binding Buffer 洗一次,棄上清再加 190μl  緩沖液、10μl PI 避光 15 分鐘

c)    加 10μl PI,避光孵育 15 分鐘;

d)   加 5μl AnnexinV 液,室溫避光孵育 15min;

e)    加 10μl PI 和 5μl AnnexinV 液,室溫避光孵育 5min;

3)   每管各加 400μl 1 ×Binding Buffer。

4)   上機(jī)檢測(cè)。

注意 a.  操作動(dòng)作要盡量輕柔,勿用力吹打細(xì)胞;

b.  操作時(shí)注意避光;

c.  反應(yīng)完畢后盡快檢測(cè),最好在一小時(shí)內(nèi)檢測(cè)。

3、用單克隆抗體 APO2.7 檢測(cè)細(xì)胞凋亡

1)   放置 0.5~1× 106 個(gè)細(xì)胞到試管中;

2)    室溫離心 200g ,6min;

3)    棄上清 ,加入 100μl 冷的(4℃ )在 PBSF 溶液中含 100µg/ml  的 digitonnin,輕輕地重懸細(xì)胞,在冰上孵育 20min;

4)   加入 2ml 冷的(4℃) PBSF 液,室溫離心 200g ,6min;

5)    棄上清, 加入 20μl PE 標(biāo)記的 Apo2.7  單克隆抗體和 80μl PBSF 液,用 vortex 輕輕震蕩,室溫避光孵育 15 分鐘;

6)   加入 2ml PBSF 液,室溫離心 200g ,6min;

7)    棄上清,加入 1ml PBSF 液重懸細(xì)胞;

8)   避光保存,直到流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

PBSF:含 2.5% FCS(v/v)和 0.01%NaN3(w/v)的 PBS。

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