腫瘤細(xì)胞在組織培養(yǎng)中占據(jù)較為重要地位。腫瘤細(xì)胞相對(duì)容易培養(yǎng)，腫瘤細(xì)胞系是目前建立的細(xì)胞類型中數(shù)量較多的。此外，腫瘤是人類疾病的大威脅。因此，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)已成為了解癌癥機(jī)制和開(kāi)發(fā)抗癌藥物的新技術(shù)。本指南旨在作為腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的基本介紹，包括培養(yǎng)基、傳代培養(yǎng)、冷凍保存和污染防治。

腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性

腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)外與正常細(xì)胞在形態(tài)、生長(zhǎng)值、遺傳性狀等方面均有顯著差異。體外培養(yǎng)的兩種腫瘤細(xì)胞定義的差異很小，但卻不相同。培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞具有以下特征：

1.不斷分化，持續(xù)生長(zhǎng)

正常細(xì)胞的生長(zhǎng)和死亡受到嚴(yán)格控制。細(xì)胞使用細(xì)胞外信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)分裂的速率和位置。一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞凋亡可以由正常的生命程序觸發(fā)。相反，腫瘤細(xì)胞提供了一種機(jī)制，使它們能夠繞過(guò)細(xì)胞周期檢查點(diǎn)并抑制細(xì)胞凋亡。在癌細(xì)胞中，有絲分裂可以連續(xù)發(fā)生，產(chǎn)生過(guò)多的細(xì)胞以形成腫瘤。

2.無(wú)接觸抑制

正常細(xì)胞會(huì)分裂，直到它們與鄰近的細(xì)胞接觸，然后它們會(huì)停止生長(zhǎng)并形成單層細(xì)胞。而癌細(xì)胞通常會(huì)失去這種接觸抑制，導(dǎo)致它們堆積并形成腫瘤。

3.侵入性

正常細(xì)胞通常位于固定位置直至死亡。但是腫瘤細(xì)胞能夠擴(kuò)散到或侵入附近的組織。此外，一些腫瘤細(xì)胞可以脫落并通過(guò)血液或淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到體內(nèi)遠(yuǎn)處，形成遠(yuǎn)離原發(fā)腫瘤的新腫瘤。

腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)原理

細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)知識(shí)現(xiàn)在相對(duì)普遍，盡管并非總是如此。細(xì)胞培養(yǎng)的主要條件是光線充足且通風(fēng)良好的實(shí)驗(yàn)室，配備的實(shí)驗(yàn)室儀器應(yīng)包括層流罩（II 級(jí)）、CO2培養(yǎng)箱、生物安全柜、臺(tái)式離心機(jī)、顯微鏡、塑料器皿（燒瓶和培養(yǎng)板）以及含有或不含血清補(bǔ)充劑的培養(yǎng)基.

培養(yǎng)基和血清

大多數(shù)培養(yǎng)基是添加了各種成分的基礎(chǔ)鹽水培養(yǎng)基。在這種含鹽培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加了氨基酸、維生素、金屬離子、微量元素和能量來(lái)源（通常以葡萄糖形式提供）以滿足細(xì)胞的需要。其他添加劑包括緩沖液和酚紅以指示培養(yǎng)物的酸度。

表 1. 常用培養(yǎng)基。

   血清通常被添加到上述培養(yǎng)基中以替代許多缺失的需求。存在的成分濃度通常在 5-20% 之間變化，具體取決于細(xì)胞類型，并且使用新生兒或胎牛血清的做法已變得很普遍。由于批次之間存在差異，因此最好堅(jiān)持使用一家發(fā)現(xiàn)與特定細(xì)胞系合作良好的供應(yīng)商。血清可分成等分試樣并冷凍在-20°C。

有些細(xì)胞類型不能在含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，例如人微血管內(nèi)皮細(xì)胞。在現(xiàn)有的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加特定的添加劑或增加各種成分的濃度都可以滿足特殊要求。 

繼代培養(yǎng)

傳代培養(yǎng)是通過(guò)將部分或全部細(xì)胞從以前的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中而產(chǎn)生新細(xì)胞或微生物培養(yǎng)物的過(guò)程。不同的細(xì)胞類型具有特定的傳代培養(yǎng)要求、優(yōu)選的密度范圍和最佳生長(zhǎng)的良好條件。所以更多的細(xì)節(jié)請(qǐng)參考我們網(wǎng)站上的具體技術(shù)公告。

冷凍保存

 為了有效地儲(chǔ)存細(xì)胞，然后回收足夠高的比例用于質(zhì)量研究，必須監(jiān)測(cè)儲(chǔ)存條件并保存良好的記錄。

  凍融引起的細(xì)胞損傷一般認(rèn)為是由細(xì)胞內(nèi)冰晶和滲透作用引起的。添加冷凍保護(hù)劑，如二甲基亞砜 (DMSO) 或甘油，并選擇合適的冷凍和解凍速率可最大限度地減少細(xì)胞損傷。雖然可以使用機(jī)械冷凍機(jī) (-75°C) 短期儲(chǔ)存細(xì)胞系，但更優(yōu)選儲(chǔ)存在液氮 (-196°C) 或其蒸氣（至 -135°C）中。使用液氮冰箱是有利的，不僅因?yàn)檩^低的溫度，因此幾乎可以無(wú)限存儲(chǔ)時(shí)間，而且還因?yàn)闆](méi)有機(jī)械故障的風(fēng)險(xiǎn)，并且現(xiàn)在可以延長(zhǎng)保存時(shí)間。

細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的污染

細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)染色無(wú)菌，定期進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè)是必要的。雖然細(xì)胞培養(yǎng)物可能在內(nèi)源性（主要是病毒）感染中產(chǎn)生，但大多數(shù)感染和污染是后天獲得的。以下是一些常見(jiàn)的文化污染，但不限于：

細(xì)菌

細(xì)菌是一大群普遍存在的單細(xì)胞微生物。由于它們的普遍存在、大小和快速生長(zhǎng)速度，細(xì)菌是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見(jiàn)的生物污染物之一。如果存在，通過(guò)肉眼觀察很容易檢測(cè)到酚紅會(huì)變黃，并且在倒置顯微鏡下細(xì)胞會(huì)被細(xì)菌菌落取代。向培養(yǎng)物中添加抗生素是常見(jiàn)的做法，這可以在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)掩蓋低水平感染。

霉菌

霉菌是真菌界的真核微生物。與細(xì)菌污染不同，培養(yǎng)物的 pH 值在污染的初始階段會(huì)保持穩(wěn)定，然后隨著培養(yǎng)物受到更嚴(yán)重的感染并變得混濁而迅速升高。在顯微鏡下，通常會(huì)出現(xiàn)菌絲體。一般來(lái)說(shuō)，在培養(yǎng)物中加入抗生素，就能在一定程度上降低感染程度。

酵母菌

酵母是單細(xì)胞真核微生物，類似于霉菌污染，被酵母污染的培養(yǎng)物變得渾濁，特別是如果污染處于晚期。被酵母污染的培養(yǎng)物的 pH 值可能不會(huì)變化太多，直到污染變重，在這個(gè)階段 pH 值通常會(huì)增加。在顯微鏡下，很明顯酵母表現(xiàn)為單個(gè)卵形或球形顆粒，甚至可能會(huì)長(zhǎng)出更小的顆粒。向培養(yǎng)物中添加抗生素效果不佳。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室通常會(huì)處理受感染的培養(yǎng)物并重新開(kāi)始。

酵母污染細(xì)胞

支原體

支原體可能是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中最常見(jiàn)和最容易被遺漏的感染，其影響是陰險(xiǎn)的。可能存在問(wèn)題的指標(biāo)包括生長(zhǎng)速度降低、形態(tài)變化、染色體畸變和新陳代謝改變。有多種檢測(cè)支原體的方法，可以使用支原體清除試劑盒進(jìn)行清除或預(yù)防。

病毒

一些細(xì)胞系包含病毒，包括整合到它們的基因組中，或作為內(nèi)源性非致死性感染。在許多情況下，這些不被視為感染，細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)化是產(chǎn)生連續(xù)細(xì)胞系的歷史悠久的方法。然而，使用病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員造成嚴(yán)重的健康危害，尤其是在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)人類或靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞時(shí)。

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